Por Yuri Jorge Peña y Yolanda Camacho,
CINVESTAV, Irapuato
Es bien sabido que la riqueza de la biodiversidad de un bosque tropical, representa una fuente inexplorada de posibles sustancias útiles al ser humano. Los bosques tropicales han servido desde hace siglos como las "farmacias" naturales a las que recurren los habitantes de esas zonas. Este conocimiento empírico ha sido recopilado por una rama de la biología llamada Etnobotánica, esta rama de la Ciencia busca probar si las plantas usadas por los habitantes de cierta región, pudieran poseer realmente las sustancias activas responsables de curar el padecimiento para el cual son usadas. Para ello, se busca establecer contacto con las comunidades y mediante su conocimiento se colectan plantas y otros materiales biológicos anotando el uso que se les da. Por ejemplo, si se trata de una planta hay que identificarla hasta género y especie, se debe anotar la región donde se colecta, si existe alguna fecha del año en que su eficacia es mayor o si solo se consigue en determinadas fechas. Además hay que saber como se prepara para ser suministrada al paciente, digamos: preparando infusiones, tés, ungüentos, etc. Posteriormente comienzan los estudios fitoquímicos, en estos se busca aislar distintas sustancias que generalmente forman parte de los metabolitos secundarios de la planta (sustancias no esenciales pe. compuestos aromáticos.) y cada uno de ellos de probará por separado para saber si poseen una actividad bactericida por ejemplo. A veces en estos estudios se descubre que el principio activo no es producido directamente por la planta, en ocasiones se trata de sustancias que se producen por organismos que viven en la planta o que tienen en algún momento contacto con ella. Una vez identificado el organismo responsable de la producción del medicamento potencial, lo que sigue es identificar el o los genes responsables de producir tal sustancia. mediante técnicas de Biología Molecular se aíslan esos genes y se clonan en organismos que sean más fáciles de manipular, o de los que sea más fácil extraer la sustancia activa por ejemplo bacterias o levaduras.
ANTECEDENTES* DE ESTA PRÁCTICA
* Algunos hechos (todos) de esta práctica son ficticios y fueron diseñados solo con fines didácticos.
En el mercado de Sonora, en la Ciudad de México un estudiante de Biología que realizaba encuestas etnobotánicas como parte de su tesis descubrió un hecho que no pudo dejar pasar: Un tendero de aspecto extraño le dijo que podía preparar un medicamento mágico, sin sospechar lo que iba a encontrar accedió a entrar a su local. Aquel sitio estaba lleno de objetos de brujería, distintas yerbas, olores y una iluminación con lámparas ultravioleta. El "curandero" sacó entonces una botella que brillaba en sus manos. Aquel medicamento era capaz de curar la diarrea y distintos malestares. El estudiante persuadió al personaje para que le mostrara cómo se preparaba la bebida. Después de recibir una "ayuda monetaria" le dejo observar creyendo el que su secreto se encontraba a salvo. En una olla con algo que parecía ser caldo de res, añadía un poco de una yerba seca, revolvía y dejaba en reposo hasta que fermentaba, curiosamente el fermento era vigilado y conforme pasaba el tiempo aparecía aquel brillo misterioso, el brillo en el caldo se observaba cuando era iluminado con luces ultravioleta. Cuando alcanzaba cierto nivel de brillantez se hervía el fermento y listo!!!. El estudiante le pidió una muestra de aquella planta y por supuesto el hombre se negó. Sólo pudo comprar una muestra del jarabe. Ya en el laboratorio de su escuela el estudiante y su tutor analizaron la muestra y pudieron aislar una proteína fluorescente que mostraba una potente actividad bactericida. Sólo se pudo concluir que por el hecho de que el caldo al inicio no presentaba brillo y después de añadir la planta el brillo aparecía en 24 hrs se pensó que posiblemente un microorganismo que crecía en aquella planta pudo haber sido cultivado en un medio como era el caldo de res, y que ese microorganismo pudiera ser responsable de la producción de esa proteína fluorescente. No se sabe nada mas.
Unos años después y sin poder revelar la fuente se te entrega una muestra de esa planta misteriosa.
TU OBJETIVO:
SI FUERA EL CASO PUEDES:
PROCEDIMIENTOS:
DIA UNO
Al material vegetal que se te proporcionó en un tubo de 50 ml agrégale 5 ml de medio líquido de cultivo. Agita bien y toma 5, 50 y 200 µl de la solución para sembrarlas en cajas petri con medio de cultivo rico.
Incubar a 37ºC toda la noche.
DIA DOS
Verificar con una lámpara de luz ultravioleta si alguna de las colonias que crecieron poseen la famosa fluorescencia verde.
Si encontraste alguna con tales características resiémbrala en una caja nueva.
Para la obtención del ADN bacteriano se deben inocular 3 ml de caldo de cultivo; utiliza la misma colonia bacteriana que escogiste para la resiembra.
Incubar el tubo toda la noche a 37ºC.
DIA TRES
Transfiere el cultivo a tubos eppendorf de 1.5 ml. Centrifuga a 8 Krpm 10 minutos, decanta el sobrenadante hasta dejar aproximadamente 200 µl de medio. Resuspende la pastilla bacteriana. Añade 200 µl de la solución de lisis (TENS)revuelve muy gentilmente volteando el tubo lentamente unas cinco veces e incuba a temperatura ambiente 10 minutos. Añade 300 µl de la solución de precipitación (Acetato de amonio 7.5M) y agita lentamente otra vez. Incuba en hielo 10 minutos. Centrifuga nuevamente y transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo. Agrega 400 µl de isopropanol, incuba a temperatura ambiente 10 minutos. Centrifuga una vez más. Agrega 500 µl de etanol al 70%, agita suavemente, desecha el etanol y deja secar la pastilla de ADN con la boca del tubo sobre papel higiénico durante 5 minutos. Resuspende el ADN en 50 µl de solución de almacenamiento.
DIA CUATRO
Para analizar las muestras de ADN que extrajiste debes cortarlas, ya que algunas moléculas son muy grandes y pueden ser fragmentadas por ciertas proteínas llamadas endonucleasas, toma 10 µl de tu muestra y añádeles 1 µl de endonucleasa (Hind III), incuba en el horno de microondas 10 segundos a máxima potencia tres veces con periodos de descanso de dos minutos entre cada incubación. Para verificar si hubo cortes en tu muestra de ADN lo debes separar de acuerdo a tamaños por medio de un gel de electroforesis.
Prepara un gel de electroforesis usando agarosa al 0.8% y buffer TAE. Para ello mezcla 10 ml de TAE y 80 mg de agarosa, fúndelos en el horno de microondas y forma el gel vaciando la agarosa fundida sobre un portaobjetos evitando que se tire (se ocupan aproximadamente 5 ml) Coloca el peine para formar los pozos antes de vaciar la agarosa. Toma 3 µl de tus muestras de ADN (intacta y cortada) y añádeles 3 µl de buffer de carga, carga en el gel 3µl de dicha mezcla tus muestras y córrelas hasta que el colorante llegue hasta ¾ partes del gel. Tiñe el gel y observa el ADN.
Para clonar el ADN que contiene el gen de la fluorescencia de debe hacer lo siguiente: Añade entre 1 y 10 µl del ADN que obtuviste a un tubo con células receptoras. A modo de experimento control toma un tubo de células receptoras y añádeles solo agua (el mismo volumen que añadiste del ADN) Incuba en hielo 30 minutos, después debes incubar a 42C 2 minutos y luego en hielo nuevamente durante cinco minutos. Añade al tubo con las células receptoras 1 ml de medio ric. Incuba a 37C media hora. Toma 200 µl del cultivo y siémbralos en cajas petri con medio rico .Incuba toda la noche a 37ºC.
ANTECEDENTES* DE ESTA PRÁCTICA
* Algunos hechos (todos) de esta práctica son ficticios y fueron diseñados solo con fines didácticos.
En una carretera de Florida a las 21:30 hrs y en un clima con fuerte viento se descubre un auto de lujo abandonado a un costado del camino, le pertenece a un empresario local, dos horas antes su familia habia recibido llamadas de supuestos secuestradores que pedian dinero a cambio de su libertad. La suma exigida fue reunida inmediatamente, la familia esperaba acceder a todas las peticiones de los secuestradores antes de perder a un ser querido, Sin embargo no hubo mas llamadas. El dia de la desaparición la víctima regresaba de un viaje de negocios en el extranjero, una hora antes de la primera llamada se le vio acompañado de otro sujeto en el aereopuerto subiendo a su auto que habia dejado ahí hacia dos semanas. En el auto se encontraron huellas dactilares de amigos, de colaboradores y de familiares, las fibras y los cabellos encontrados pertenecían al igual que las huellas a gente cercana a la víctima o alguna otra evidencia. En el asiento del conductor se hallaron cabellos de la víctima. La conclusión inicial indicaba que algúna persona cercana al infortunado empresario había tramado el secuestro pero quien?. Cada una de las personas sospechosas que fue entrevistada tenía una coartada. Pasaron los dias y no hubo noticias del empresario y la policia lo dio por extraviado. Algunos dias después en una playa cercana unos pescadores descubrieron el cuerpo de un hombre, se trataba de la persona extraviada. El caso parecia muy complicado para los fiscales pero se cree que puede ser resuelto satisfactoriamente gracias a la astucia del perito que analizó el auto. Mientras el perito recogía la primera evidencia fue molestado por un mosquito intentó matarlo y falló, solo cayó aturdido frente a él. Inmediatamente pensó que era imposible que con el viento que hacia el mosquito hubiera entrado del exterior, el mosquito tuvo que haber estado ahí desde unas horas antes, el mosquito a la luz de la linterna lucía inflado por la sangre de... de... de quien? suya? del empresario? de su raptor?, lo tomó como evidencia y obtuvo en el laboratorio una huella genetica de la sangre contenida en su abdomen.
Como este tipo de pruebas debe ser realizada por terceros y no por fiscales. Te entregamos ADN extraído de la sangre del abdomen del mosquito. ADN del mosquito extraído de una de sus alas. ADN de la víctima, extraída de uno de sus cabellos y ADN de tres sospechosos: El vicepresidente de la Compañía, La esposa del empresario y del Jardinero de la casa.
TU OBJETIVO:
YA ENCARRERADO PUEDES:
PROCEDIMIENTOS:
DIA SEXTO:
Para visualizar las distintas muestras de ADN, prepara un gel de electroforesis usando agarosa al 0.8% y buffer TAE. Toma 10 µl de tu muestras de ADN (intacta y cortada) y añádeles 3 µl de buffer de carga, carga tus muestras en el gel y córrelas hasta que el colorante llegue hasta ¾ partes del gel. Tiñe el gel y observa el ADN.
Analiza el patrón observado, mediante pruebas estadísticas se ha establecido que una banda de ADN en una posición dada puede repetirse entre individuos con una frecuencia de 1/500, dos bandas en la misma posición representaría una posibilidad de 1/500 X 1/500, es decir dos individuos de cada 250000 poseen dos bandas en la misma posición. Para cuatro bandas la probabilidad en de aproximadamente 2 de cada 62500000000 personas.
Identifica al asesino comparando la presencia de bandas.